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发表期刊：The plant cell影响因子：10.0中科分区：生物学1区Top发表时间：2023.02
研究背景
种子萌发是植物生命周期中一个关键的转折点。它决定了幼苗是否能够尽快建立起独立的营养体系,顺利度过最为脆弱的幼苗阶段。要想在最佳时间发芽,种子需要精准感知和整合来自环境的各种信号，比如光照、温度和水分等。其中光照无疑是最关键的萌发诱导因子之一。
植物体内两种主要的植物激素-赤霉酸(GA)和脱落酸(ABA),在调控种子萌发过程中起到了关键作用。GA可促进种子萌发,而ABA则抑制种子萌发。光活化的光敏色素B(phyB)可通过调节这两种激素的动态平衡来诱导种子萌发。但phyB具体是如何调控ABA代谢的分子机制尚不明晰。
双子叶植物种子萌发过程中的形态和关键生理过程
长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA分子,近年来逐步被证实在植物生长发育中扮演着重要角色。相比于经典的转录因子调控方式,lncRNA可以更快速、更广泛地整合各种外界和内在信号,协调调控一系列目标基因的表达。前期的研究中发现lncRNA HID1（236nt）可作为染色质结合lncRNA来调控光依赖性幼苗发育。
本研究中发现了lncRNA HID1(Hidden Treasure 1)为phyB下游的关键调控因子，通过抑制ABA生物合成来促进光诱导的种子萌发。这项工作不仅阐明了phyB调控种子萌发的分子机制,也揭示了lncRNA在这一生命过程中发挥的重要作用。让我们一起来了解这项研究的主要发现吧！
PhyB调控种子萌发和休眠的工作模式
研究思路和研究结果
1. HID1是phyB依赖性种子萌发的正调节因子
为了鉴定在拟南芥红光诱导的种子萌发期间起作用的ncRNA，利用phyB依赖性方案筛选了一组农杆菌转移的T-DNA插入突变体，这些突变体在延迟或加速种子萌发表型的特定ncRNA的表达中受到损害。
在筛选中，HID1-ncRNA突变体在phyB依赖性种子萌发期间表现出较低的发芽率，HID1突变体的发芽率只有正常种子的发芽率的70%；phyB-off条件下，phyB不活跃，WT和HID1种子均未萌发。结果表明HID1是phyB介导的种子萌发的正调节因子，HID1在phyB依赖性萌发中发挥正向作用。后续使用表达HID1的转基因系验证证实了HID1作为ncRNA促进红光诱导的种子萌发。且前期研究表明HID1的SL2和SL4茎环对HID1介导的种子萌发至关重要。
Hid1-ncRNA突变体在phyB-on条件下表现出萌发延迟
2. PhyB 促进HID1在胚根中的积累
使用Phid1:GUS报告基因标注HID1启动子研究phyB-on条件下种子萌发过程中的HID1的空间表达模式，实验结果染色显示，HID1启动子主要在胚胎中活跃，48h后主要在胚根中高度活跃；phyB-off状态下48h后HID1启动子几乎失活；综上结果表明，在萌发过程中，胚根中HID1启动子的表达受到phyB的调节。
原位杂交研究12/24/48hDAL后WT和phyB突变系种子中的HID1的表达，phyB-on状态下HID1主要在48h后的胚根中表达；phyB缺失的情况下，48h后消除了胚根中的HID1的表达，表明phyB在种子萌发期间促进了胚根中HID1的积累；使用核标记物进行核定位结果显示，HID1主要位于细胞核。综上结果表明在phyB-on条件下，HID1在胚根和细胞核中逐渐富集。
PhyB促进HID1在胚根中的核积累
3. HID1和phyB-on条件下48h共同调控多种植物激素基因的表达
进一步探索HID1在phyB依赖性种子萌发中的功能：在phyB-on条件下孵育的WT/hid1/phyB种子，然后在12/24/48DAL后采样进行mRNA-seq。组学结果显示在phyB-on条件下hid1 / WT和phyB / WT比较揭示的转录组差异相似，表明phyB和HID1在DAL48 h后共调控了一大批基因。GA和ABA激活的信号通路之间的平衡是种子萌发的重要调节因子，phyB在DAL12h后抑制PIF1，以调节GA和ABA通路中基因的表达，选取几个GA和ABA调控基因定量结果表明，DAL48h后上述GBA和GA调控基因受HID1和phyB共同调控。
PhyB-on条件下，HID1和phyB在48h DAL时在转录水平上共同调节大量基因
GO功能富集分析结果显示，DAL48h后，phyB和hid1系中上调的基因显著富集到ABDA刺激反应，ABA代谢过程，种子发育和水反应等功能上，下调的基因主要富集到对激素的反应和细胞代谢上。
转录组数据的进一步分析表明，HID1在12h和24h节点上的种子萌发只起到次要作用。48hDAL后，ABA相关信号通路基因表达水平逐渐降低，GA、BR和生长素等信号通路的基因表达逐渐升高；综上表明，HID1的缺失导致植物激素网络的转录重编程，GA和其他促进萌发的植物激素的相关基因表达升高，ABA相关基因表达降低；进一步的实验表明，HID1的过表达缓解了phyB突变体在phyB-on条件下的种子萌发缺陷，且hid1-phyB双突变体在phyB-on状态下无法萌发；与WT项目，hid1系中参与ABA合成和信号传导中的基因表达显著上调；综上，HID1和phyB的下游起作用，介导促进种子萌发的转录组变化。
HID1通过调节与ABA核GA相关的代谢和信号转导基因的表达来促进phyB依赖性种子萌发
4. HID1与NCED9染色质结合并抑制其转录，进而抑制ABA生物合成来促进phyB依赖性种子萌发
研究通过正向遗传筛选，进一步探索HID1调节phyB依赖性种子萌发的机制，确定phyB-HID1通路的关键下游成分。hid1缺陷种子的ABA水平明显高于WT种子种的ABA水平，而GA4则正好相反；HID1通过抑制ABA生物合成促进phyB依赖性种子萌发。进一步的实验表明，phyB-HID1调控轴的激活主要是通过抑制ABA生物合成来促进48h DAL后的种子萌发。
HID1通过抑制ABA生物合成促进phyB依赖性种子萌发
前期结果表明HID1结合染色质并调控转录，研究通过ChIRP-seq研究了HID1的基因组结合位点。通过peak calling鉴定出396个基因有结合peak，研究在NCED9（ABA生物合成的关键基因）的基因位点发现了比较强的信号peak，随后的ChIRP-qPCR证实了HID1与NCED9基因染色质的结合；phyB突变体中，HID1在NCED9位点的结合率大大降低，表明在种子萌发过程中HID1在NCED9位点的结合需要phyB。
HID1作为一个负调控因子，可直接抑制ABA合成关键酶NCED9的表达，从而降低ABA水平，为种子萌发创造有利条件。此外，HID1还与另一个染色质调节因子ATXR7相互作用，ATXR7是一种H3K4me3甲基转移酶。HID1通过抑制ATXR7在NCED9启动子区的结合和H3K4me3修饰，进一步降低了NCED9的转录活性。
HID1与NCED9基因座结合并抑制其转录
综上所述，phyB通过调控HID1这个lncRNA，在转录水平上抑制ABA生物合成的关键基因NCED9的表达，从而降低ABA水平，促进种子萌发。这是phyB调控ABA代谢的一个全新机制。
5. HID1抑制H3K4me3在其抑制的靶基因上的富集-H
研究为了评估HID1是否介导phyB依赖性种子萌发期间其靶基因蛋白修饰的变化，检查了phyB-on条件下48hDAL后WT和hid1种系中活性基因表达标记H3K4me3和抑制基因表达标记H3K27me3的基因组图谱。ChIP-seq结果数据中，筛选出了131个和HID1相关的差异表达基因进行后续分析，结果表明，HID1定向的转录变化可能与HEK4me3变化偶联，与WT相比，hid1中HID1抑制靶基因的5’端H3K4me3密度显著升高，而HID1激活的基因的H3K4me3的密度降低。综上结果表明，HID1可以调节HEK4me3的占有率并调节基因的表达。
ATX1（甲基转移酶）会介导H3K4me3的建立，并激活ANA依赖性应激反应基因的表达；研究推测HID1通过调节H3K4me3修饰介导NCED9的转录抑制。通过构建突变体实验证实了ATXR7是HEK4me3沉积和NCED9激活所必需的。
RIP评估了HID1和ATXR7在体内的相互作用，结果表明，ATXR7在体内与HID1免疫共沉淀，同时通过ChIP-qPCR结果表明，与WT相比，hid1突变系中ATXR7在ATXR7峰区内NCED9染色质上的占有率大大增强，表明HID1会抑制ATXR7在NCED9上的结合。
HID1拮抗H3K4me3和ATXR7在NCED9位点的积累
研究总结&结果讨论
植物已经进化出精巧的机制来调节种子萌发，拟南芥种子通过光感受器将外部光信号转导为内部植物激素信号，以诱导种子萌发；本研究中，通过该框架证实了phyB促进ncRNA HID1的胚根积累抑制ABA生物合成，以促进中24hDAL后的高效萌发；本研究表明，phyB-HID1调控轴的激活促进了红光引发的种子萌发，我们的工作通过HID1在phyB和ABA生物合成基因之间建立了新的联系，揭示了由ncRNA介导的种子萌发的光依赖性调节机制。
HID1 不仅参与了phyB信号转导,调控ABA代谢,还广泛整合了GA代谢以及其他植物激素相关基因的表达。研究发现,HID1不仅抑制ABA生物合成基因,也促进GA生物合成相关基因的表达。这样一来,HID1就协调调控了ABA和GA两种拮抗激素的平衡,为种子萌发创造了最佳条件。除此之外,转录组分析结果还显示,HID1和phyB共同调控了一组参与植物激素信号转导的基因,包括AUX/IAA、ARF、ABF等转录因子。这说明HID1不仅作用于ABA和GA代谢,还可能影响auxin、赤霉素等其他植物激素的信号途径,从而整合多种环境和内源信号,精准调控种子萌发过程。
综上,HID1作为一个关键的转录调控因子,不仅受phyB的调控,自身也整合了多种植物激素信号,构建了一个复杂的调控网络,精准调控种子萌发这一关键生命过程。这一发现不仅丰富了我们对植物生长发育调控机制的认知,也为未来农业生产提供了新的靶点。
HID1 介导的 phyB 依赖性种子萌发的简化工作模型
参考文献
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